細(xì)胞培養(yǎng)污染往往是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室最常遇到的問題，有時(shí)會(huì)帶來十分嚴(yán)重的后果。細(xì)胞培養(yǎng)的污染物可分為兩大類，化學(xué)污染物，如培養(yǎng)基、血清和水的雜質(zhì)、內(nèi)毒素、增塑劑和洗滌劑，以及生物污染物，如細(xì)菌、霉菌、酵母、病毒、支原體，以及其他細(xì)胞系的交叉污染。雖然不可能完全消除污染，但通過徹底了解其來源并遵循良好的無菌技術(shù)，就可以減少其發(fā)生的頻率和嚴(yán)重性。
生物污染的主要類型：
細(xì)菌污染
細(xì)菌是普遍存在的單細(xì)胞微生物。它們的直徑通常為幾微米，并且可以具有各種形狀，從球體到棒狀和螺旋狀。由于它們無處不在和生長速度快，細(xì)菌以及酵母菌和霉菌是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見的生物污染物。
檢測細(xì)菌污染
在被感染后的幾天內(nèi)，通過肉眼檢查培養(yǎng)物很容易檢測到細(xì)菌污染；受感染的培養(yǎng)物通常出現(xiàn)渾濁（即渾濁），有時(shí)表面有一層薄膜。培養(yǎng)基的 pH 值突然下降也經(jīng)常遇到。在低倍顯微鏡下，細(xì)菌表現(xiàn)為細(xì)胞間微小的移動(dòng)顆粒，在高倍顯微鏡下觀察可以分辨出單個(gè)細(xì)菌的形狀。
下面的圖像顯示了被大腸桿菌污染的貼壁 293 細(xì)胞培養(yǎng)物。
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圖A：被大腸桿菌 污染的貼壁 293 細(xì)胞的相差圖像。貼壁細(xì)胞之間的空間在低倍顯微鏡下顯示出微小的閃爍顆粒，但單個(gè)細(xì)菌不易區(qū)分（圖 A）。進(jìn)一步放大黑色方塊包圍的區(qū)域可以分辨出單個(gè)大腸桿菌細(xì)胞(圖B)，這些細(xì)胞通常是棒狀的，長約 2 μm，直徑約 0.5 μm。面板 A 中黑色方塊的每一邊為 100 μm。 |
霉菌污染
霉菌是真核微生物，以稱為菌絲的多細(xì)胞細(xì)絲形式生長。這些多細(xì)胞細(xì)絲的連接網(wǎng)絡(luò)包含基因相同的細(xì)胞核，被稱為菌落或菌絲體。
與酵母菌污染類似，培養(yǎng)物的 pH 值在污染的初始階段保持穩(wěn)定，然后隨著培養(yǎng)物受到更嚴(yán)重的感染并變得渾濁而迅速增加。在顯微鏡下，菌絲體通常表現(xiàn)為細(xì)絲狀，有時(shí)表現(xiàn)為更密集的孢子團(tuán)。許多霉菌物種的孢子在其休眠階段可以在極其惡劣和不適宜居住的環(huán)境中生存，只有在遇到合適的生長條件時(shí)才會(huì)被激活。
病毒污染
病毒是借助宿主細(xì)胞進(jìn)行繁殖的微觀感染因子。它們極小的個(gè)體大小使得它們很難在培養(yǎng)中檢測到，也很難從細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室使用的試劑中去除。因?yàn)榇蠖鄶?shù)病毒對(duì)其宿主有非常定向的依賴，它們通常不會(huì)對(duì)宿主以外物種的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生不利影響。然而，使用病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物可能對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員造成嚴(yán)重的健康危害，尤其是在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)人類或靈長類動(dòng)物細(xì)胞時(shí)。
細(xì)胞培養(yǎng)物的病毒感染可以通過電子顯微鏡、使用一組抗體的免疫染色、ELISA 測定或使用適當(dāng)病毒引物的 PCR擴(kuò)增來檢測。
支原體污染
支原體是沒有細(xì)胞壁的簡單細(xì)菌，被認(rèn)為是最小的自我復(fù)制生物。由于它們的尺寸極?。ㄍǔＰ∮谝晃⒚祝?，支原體很難被檢測到，直到它們達(dá)到極高的密度并導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)物變質(zhì)；在此之前，通常沒有明顯的感染跡象。
檢測支原體污染
一些生長緩慢的支原體可能會(huì)在培養(yǎng)物中持續(xù)存在而不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，但它們可以改變培養(yǎng)物中宿主細(xì)胞的行為和新陳代謝。
慢性支原體感染可能表現(xiàn)為細(xì)胞增殖率降低、飽和密度降低和懸浮培養(yǎng)中的凝集；然而，唯一可靠的檢測支原體污染的方法是定期使用熒光染色（例如，Hoechst 33258）、ELISA、PCR、免疫染色、放射自顯影或微生物測定對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行檢測。
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無支原體的培養(yǎng)細(xì)胞（圖 A）和感染支原體的細(xì)胞（圖 B 和 C）的顯微照片。可以使用支原體檢測試劑盒測試培養(yǎng)物。
酵母菌污染
酵母菌是單細(xì)胞真核微生物，大小從幾微米（通常）到 40 微米（很少）不等。
檢測酵母污染
與細(xì)菌污染一樣，被酵母菌污染的培養(yǎng)物會(huì)變得渾濁，尤其是當(dāng)污染處于晚期時(shí)。被酵母菌污染的培養(yǎng)物的 pH 值幾乎沒有變化，直到污染變得嚴(yán)重，在此階段 pH 值通常會(huì)增加。在顯微鏡下，酵母表現(xiàn)為單個(gè)卵形或球形顆粒。
下面的圖像顯示了接種后 24 小時(shí)被酵母感染的貼壁 293 細(xì)胞培養(yǎng)物。
貼壁培養(yǎng)中被酵母污染的 293 細(xì)胞的圖像。污染的酵母細(xì)胞呈現(xiàn)為卵形顆粒，在復(fù)制時(shí)會(huì)萌生出較小的顆粒。
交叉感染
雖然不像微生物污染那么常見，但許多細(xì)胞系與 HeLa 和其他快速生長的細(xì)胞系的廣泛交叉污染會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的后果。從值得依賴的細(xì)胞庫中獲取細(xì)胞系，定期檢查細(xì)胞系的特征，并采用良好的無菌技術(shù)，這些做法將幫助您避免交叉污染。DNA 指紋圖譜、核型分析和同種型分析可以確認(rèn)您的細(xì)胞培養(yǎng)物中是否存在交叉污染。
使用抗生素
不應(yīng)在細(xì)胞培養(yǎng)中經(jīng)常使用抗生素，因?yàn)樗鼈兊某掷m(xù)使用會(huì)促進(jìn)抗生素耐藥菌株的產(chǎn)生，并使低水平污染持續(xù)存在，一旦從培養(yǎng)基中去除抗生素，就會(huì)發(fā)展成全面污染，并可能隱匿支原體感染和其他神秘的污染物。此外，一些抗生素可能與細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)并干擾正在研究的細(xì)胞生長過程。
抗生素只能作為最后的手段，并且只能用于短期應(yīng)用，并且應(yīng)該盡快從培養(yǎng)物中去除。如果長期使用，應(yīng)同時(shí)維持不含抗生素的培養(yǎng)物，作為隱匿感染的對(duì)照。
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